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如何用制备色谱柱制备低含量的杂质？

制备色谱柱为ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson馏分收集器，色谱仪为Agilent1100或LC-6A。想用其制备面积归一化法含量为0.05%左右的杂质，初步提纯后用高分辨的LC-MS进行定性分析。如何设定色谱条件，如，流量、进样量、样品的浓度、切割点的设置、是否要浓缩，要求将95%以上的主峰切除。

（主峰后有二个杂质靠得很近。）

答：

1.制备用的流动相尽量等级高一点，否则流动相中的杂质会影响LC-MS分析。

2.使用馏分收集器时，延迟体积一定要计算准确，检测器的响应时间设到很小，否则都会影响收集的纯度和回收率。制备柱的流速一般与直径的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速为1mL/min，9.4mm制备柱用1*（9.4/4.6）2,大约为4mL/min。进样量设到几个mg应该基本没有过载。进样样品浓度越高越好。假如进样10mg，理论计算0.05%的杂质大约只有5μg，显然浓度太低，尽量是多做几次，合并馏分然后浓缩后做LC-MS分析。

工业制备色谱

工业色谱又称制备色谱。利少{J组分的差速迁移而实现I.业规模混合物分离的方法它包括一个流动相(被分离的气相或液相)和一个固定相。两相在色谱柱r}，进行接触，在色谱柱‘l，流动相沿固定相流动，由」几混合物中各组分被固定相滞流程度不同，它们随流动相移动的速度就不同，因而可使各组分.4.相分离。根据流动相的不}.可，可分为}L相色谱与液相色谱两类。根据固定相的类型，可分为吸附色谱、分配色iH离子交换色谱、亲和色潜‘排I}}L色谱五类。上业色谱可分离选择性系数非常接近的组分，它适用于热敏N}物质的分离，对制备高纯物质特别有效

蛋白质是具有一定构象(空间结构)的生物大分子:其一级结构是形成肽链的氨基酸序列(数目、种类、顺序)，是蛋白质结构的基础;在一级结构水平上，部分肽链发生卷曲和折叠，形成其二级结构，这种卷曲和折叠是靠肽链中的羰基与氨基之间的氢键维持的:在二级结构的基础上，多肽链再盘绕和折叠，形成三维空间形态，即为蛋白质的三级结构:而蛋白质的四级结构是指同一蛋白质中各条肽链之间的相互关系。

蛋白质的特点使得其分离过程与传统化工分离过程有着极为不同的特点:(1)分离对象是具有特定的生物活性的生物大分子产品，分离过程设计中不恰当的物理和化学环境等(如温度、PH值、缓冲液选择、、搅拌和剪切力等)皆有可能引起其蛋白质分子结构发生改变，从而使之失活;(2)由于发酵液、细胞培养液或匀浆液中，我们所需要的目标产物往往存在于含有许多性质十分相似的杂质的稀溶液中，如何从这样一种复杂的稀溶液中经济有效地提取产物是生物分离技术面临的重大课题;(3)从卫生和安全角度出发，对于用基因工程产品，有着极高的纯度和同一性要求，对其中的有害杂质去除率要求极高，对分离设备材质和分离过程中引入的分离介质也有着严格的限制。