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液相色谱仪在生物制药中的应用

液相色谱仪是近几十年发展起来的一种、的分离分析技术，是现代分离检测的重要工具。液相色谱仪是以经典液相色谱仪为基础，引入气相色谱仪的理论和实验方法，将流动相改为高压输送，采用固定相和在线检测等手段，发展而成的分离分析技术，具有高压、高速、、高灵敏度、高选择性和应用范围广等特点，成为生物制药领域发展快、应用的现代分析技术之一。

液相色谱柱外界因素影响

色谱是一种分离分析手段，分离是，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3,5,7,10μm等，柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效；对于同系物分析，只要500即可；对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。

柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。即使好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。

液相色谱柱流动性

1、在进行样品检测前，至少使用20倍柱体积流动相使色谱柱充分平衡。流动相一定要使用色谱级别的溶剂。如使用水相的缓冲液应当天配制以保持新鲜避免细菌产生。

2、流动相使用前需用微孔滤膜过滤,消除流动相中颗粒对色谱系统和色谱柱的损坏。缓冲液与其他流动相混合后应重新过滤避免溶解度变化造成产生新的沉淀。不应使用纯水作为流动相冲洗C18色谱柱，以免柱性能损坏（添加5%的冲洗色谱柱，同时可以达到对缓冲盐清洗的作用。还可以使色谱柱更容易平衡）。

3、流动相需脱气后使用，可避免因气泡导致的泵和检测器的工作不正常。如果测试时使用的流动相与色谱柱保存使用的流动相有较大区别，应该使用过度分布的形式进行平衡。避免由于流动相的突然变化造成柱压增加过大或流动相缓冲盐结晶造成对色谱柱和仪器系统的损坏。正相色谱柱比反相色谱柱需要更长的平衡时间。

液相色谱柱的构造

液相色谱柱由柱管、压帽、卡套式接头（密封圈）、篦板（过滤芯）、连接头、螺钉（筒体）与柱填料等构成。 柱管：常用不锈钢板做成，如果应用时柱压不高过70kg/cm2时，也可选用厚壁管夹层玻璃或石英加热管，管内腔规定有很高的光滑度。用以柱填料的填装。空柱各部件均为金属材质，能承受一般的功效。但因为含氟化物的对其有一定的腐蚀，故应用时要留意，柱及联接管中不可以长期留存该类，以防止浸蚀。压帽：即离子交换柱两边套合于柱管端表面的塑性变形圆柱体帽，中间有小圆孔，多见聚四氟乙烯做成，用以固定不动篦板。 密封圈：坐落于连接头螺旋式环内腔的延展性环，多见聚四氟乙烯做成，用以离子交换柱两边压帽与柱表面的密封性。