注意事项：从原理上讲，所有菌都可用瓷珠菌保存管保存。菌保存的原理是DNA-copy时自发突变导致菌退化，因此要创造代谢不活泼的状态，干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌的时间就越长。但需要注意的是，由于苛刻菌(如流行感嗜血杆l菌、脑l膜炎萘瑟氏菌)等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。
这种因细胞内部结冰而致的细胞损
螺口冷冻管厂家
注意事项：从原理上讲，所有菌都可用瓷珠菌保存管保存。菌保存的原理是DNA-copy时自发突变导致菌退化，因此要创造代谢不活泼的状态，干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌的时间就越长。但需要注意的是，由于苛刻菌(如流行感嗜血杆l菌、脑l膜炎萘瑟氏菌)等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。
这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。同时随着温度的下降,细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死l亡。这种因保存溶液溶质浓度升高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。
2)离心洗涤:向培养瓶内加5~10m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1000rpm 离心8~10分钟后弃去上清液。
3)细胞悬液的制备:向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万/ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为1ml。
4)致冷冻:将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻保存:a. 4℃两小时后移至-20℃作用2小时，再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。b. -20℃4小时后移至-40℃，经4小时移人-70℃冰箱24小时，投入液氮。c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。
低温保护剂的应用：在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓过程，能使细胞内水分在冻l结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法：预先配制冻存液:含 20%血l清培养基；10% DMSO；取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1~5X10细胞/ml)；加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞复苏方法：(1) 从液氮中取出冷冻管，迅速投入37~38 C水浴中，使其融化(1 min左右)。(2) 5 min内用培养液稀释至原体积的10倍以上。(3)低速离心10 min。(4)去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
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