注意事项:从原理上讲,所有菌都可用瓷珠菌保存管保存。菌保存的原理是DNA-copy时自发突变导致菌退化,因此要创造代谢不活泼的状态,干燥、低温、缺氧、缺营养的环境,创造的环境越接近此状态,所保存的菌的时间就越长。但需要注意的是,由于苛刻菌(如流行感嗜血杆l菌、脑l膜炎萘瑟氏菌)等特殊细菌保存时,需-80℃或更低温度保存,才可以做到更长期的保存。
这种因细胞内部结冰而致的细胞损
螺口冷冻管厂家
注意事项:从原理上讲,所有菌都可用瓷珠菌保存管保存。菌保存的原理是DNA-copy时自发突变导致菌退化,因此要创造代谢不活泼的状态,干燥、低温、缺氧、缺营养的环境,创造的环境越接近此状态,所保存的菌的时间就越长。但需要注意的是,由于苛刻菌(如流行感嗜血杆l菌、脑l膜炎萘瑟氏菌)等特殊细菌保存时,需-80℃或更低温度保存,才可以做到更长期的保存。
这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成,冷却速度越快,冰晶损伤越大。同时随着温度的下降,细胞外部的水分会先结冰,从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高,细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏,细胞发生渗漏,导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死l亡。这种因保存溶液溶质浓度升高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢,使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成,冷却速度越慢,此损伤越严重。
2)离心洗涤:向培养瓶内加5~10m1预冷的MEM使细胞悬浮,再将其吸出置灭菌离心管中,以1000rpm 离心8~10分钟后弃去上清液。
3)细胞悬液的制备:向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液,使细胞浓度为150~400万/ml,然后迅速分装于安瓿瓶中,每瓶加量为1ml。
4)致冷冻:将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内,直立置不同条件下致冷冻保存:a. 4℃两小时后移至-20℃作用2小时,再移入-40℃4小时后在-70℃下24小时投入液氮。b. -20℃4小时后移至-40℃,经4小时移人-70℃冰箱24小时,投入液氮。c. -40℃4小时后移入-70℃24小时后投入液氮。d. -20℃4小时后移入-70℃经24小时后投入液氮中。
低温保护剂的应用:在细胞冻存时加入温保护剂,能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO,它是一种渗透性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水的通透性,降低冰点,延缓过程,能使细胞内水分在冻l结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存方法:预先配制冻存液:含 20%血l清培养基;10% DMSO;取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液(1~5X10细胞/ml);加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞复苏方法:(1) 从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38 C水浴中,使其融化(1 min左右)。(2) 5 min内用培养液稀释至原体积的10倍以上。(3)低速离心10 min。(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
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