香椿又名春芽树、椿、椿树,在《植物名实图考》中称为红椿,属楝科香椿属落叶乔木,是我国特有树种,分布于华北至华南和西南各省。研究发现香椿叶含有黄酮类化合物。鉴于黄酮类化合物具有保肝、降血压、抗炎、泻下、解痉等多种生理活性功效,香椿叶黄酮类化合物的研究日益引起了人们的重视。天然药用植物中总黄酮的测定方法主要有紫外分光光度法、铝盐显色可见光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。薄层色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法主要用于测定黄酮单体成分,总黄酮的测定主要采用分光光度法。AICl3显色分光光度法测定香椿叶总黄酮的方法研究尚未见报道,作者研究用三氯化铝显色可见光分光光度法测定香椿叶中总黄酮的方法,旨在建立一种、经济简便的光度分析法。
1实验部分
1.1仪器与试剂
uv/Vis2802PCS型分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);7230G型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);E01140型电子分析天平Swizerland;PHS-3C型精密pH计(上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂);GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);芦丁(四川光泰制药有限公司产品);体积分数95%乙醇;AICl3,乙酸钠,冰乙酸均为分析纯。水为自制新鲜蒸馏水。
所用香椿叶于2005年11月下旬采自中南林业科技大学株洲校区,由中南林业科技大学刘克旺教授鉴定。采后冲洗并将叶片与叶轴分开,叶片在烘箱中50℃烘至手捏碎(粒度约1mm),碎片贮于干燥器中置暗处保存备用。
1.2实验方法
准确称取经105℃干燥至恒量的芦丁标准试剂0.0752g,用体积分数30%乙醇60℃水浴溶解,并定量转入250mL容量瓶中,用30%乙醇定容,摇匀得0.3008g/L标准溶液。
称取15g香椿叶片放入250mL锥形瓶中,水浴加热控制80℃,用体积分数80%的乙醇,在1:10(次)、15(第2、3、4次)料液比的条件下,浸提4次,每次2h,过滤,用少许80%的乙醇洗涤滤渣,合并滤液和洗液,得香椿叶总黄酮提取液486mL
准确移取一定量的芦丁标准溶液或香椿黄酮提取液于25mL容量瓶中加入1.0mL0.5mol/LAICl3溶液摇匀放置15min,再用pH5.8的NaAcHAc缓冲溶液定容混匀,超声振荡5min后以空白试剂为参比,用1cm吸收皿在415nm波长处测其吸光度。
2结果与讨论
2.1测定波长的选择
准确吸取1.0mL的芦丁标准溶液或香椿黄酮提取液直接和按实验方法显色,再分别用pH3.6、4.0、5.0、5.8的NaAc-HAc缓冲溶液定容混匀,超声振荡5min后在分光光度计上用1cm比色皿在波长从300~600nm区间扫描(以试剂空白作参比),波长间隔选1nm。芦丁标准溶液显色前、后扫描曲线见图1,香椿叶总黄酮提取液显色前、后扫描曲线见图2。
由图1、2可知:芦丁标准溶液和香椿叶黄酮提取液显色后都在415nm附近有吸收,且两者在用pH5.8的NaAc-HAc缓冲溶液定容后的扫描曲线的波长接近415nm故本实验选用pH5.8的NaAc-HAc缓冲溶液,415nm为测定波长。
2.2显色剂AICl3用量的选择
按实验方法取1.0mL的标准溶液,分别加入0.4~1.4mL间隔为0.2mL0.5mol/LAIC1,溶液,测定A值。结果表明:0.5mol/L三氯化铝溶液用量在0.8~1.4mL范围内,对标准溶液显色后的吸光度影响很小,本试验选用0.5mol/L三氯化铝溶液1.0mL。
2.3显色温度的选择
取1.0mL的标准溶液按实验方法,控制显色温度为12、15、20、25、30、35℃显色后测定A值。结果表明:显色温度在12~35℃范围内,对标准溶液显色后的吸光度影响很小。本试验采用室温条件。
2.4显色时间的选择